獸用寄生蟲疫苗研究進展

來源：  發布日期：2011-02-12  發布者：曉天  共閱1382次

　隨著寄生蟲學者對寄生蟲形態、結構等特征的研究，寄生蟲免疫學開始揭曉。目前使用的寄生蟲疫苗主要是活苗或致弱苗，屬勞動密集性產品，主要集中于原蟲，包括球蟲、弓形蟲、新孢子蟲、巴貝斯蟲、梨形蟲和賈第蟲等，而針對線蟲、絳蟲和體外寄生蟲的疫苗相對較少。
　　寄生蟲疫苗不像細菌與病毒苗那樣容易研制成功，主要是因為寄生蟲是真核生物，大多數是多細胞動物，有著復雜的生活史，雖然在寄生蟲的離體培養上取得了一定的成就，但是絕大多數寄生蟲還不能在人工條件下離開宿主培養；寄生蟲抗原復雜、易變異、偽裝、表面抗原脫落與更新，使宿主難以產生保護性免疫應答。
　　現分別將已成功研制和正在研制的疫苗的研究進展及應用情況介紹如下。

　　一、已研制成功的疫苗
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　　從目前使用的獸醫寄生蟲疫苗類型來看，致弱活疫苗占有絕對優勢，其保護機理主要是模仿自然感染，刺激機體產生免疫應答。但活疫苗也存在不少問題：
　　安全性問題：活苗雖然可以產生一定的免疫保護，但畢竟是活的蟲體，在特定的情況下，仍有致病的可能；
　　免疫保護效果不一：有些寄生蟲可以感染多種動物，其疫苗往往對某種動物保護效果較好，對另種動物保護效果較差，或者對不同年齡的動物保護效果不一致；
　　經濟效益：盡管有些疫苗免疫保護性好，但生產成本高、免疫方法復雜、與抗寄生蟲藥的廣譜性相比具有較窄的保護范圍。
　　正是由于上述問題的存在，在一定程度上制約了致弱寄生蟲疫苗的使用，同時，也促使相關人員去研究和開發新的疫苗。
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　　寄生蟲的分泌或代謝產物具有很強的抗原性。制備分泌抗原苗的一種途徑就是在具備成功的培養技術的前提下,可以從培養液中提取有效抗原作為制備蟲苗的成分。這方面最成功的例子有牛的巴貝斯蟲苗和犬的巴貝斯蟲苗,分別在澳大利亞和歐州廣泛應用。這種蟲苗實際上是一種混合苗,它包括多種成分,在應用時往往需要佐劑和多次接種,而且其前期技術條件(病原體的培養)要求較高,并需要一定的資金投入,成本上有時不易被接受。制備分泌抗原苗的另一個途徑是從發病動物體內直接提取抗原。例如從發病泰勒蟲病牛血清中提取的抗原可以再免疫其它易感牛。
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　　在抗寄生蟲感染方面，已對DNA疫苗研究展開了積極的探索。在日本，分體吸蟲、絳蟲、瘧原蟲、利什曼原蟲、隱孢子蟲、弓形蟲、錐蟲、球蟲等疾病中，DNA疫苗研究已經取得了較好的進展，其中瘧疾DNA疫苗已獲準生產。
　　重組基因工程苗在寄生蟲方面成功的例子為血吸蟲重組基因工程苗,以重組GST(谷胱甘肽-S-轉移酶)為代表的基因工程苗在動物和人體上都進行了試驗,保護效果在50%以上。該蛋白質在血吸蟲的各個發育時期(包括蟲卵期)都有表達。另外，該抗原還可在大腸桿菌內高效表達,且提純方法極為簡單。

　　二、正在研制的疫苗
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　　瘧疾疫苗的研制是瘧疾防治中的重要內容。從70年代的全蟲活疫苗，到80年代的基因工程亞單位疫苗（如MSP1、EMP1等）和化學合成多肽疫苗（如SPf66）,由于其激發的免疫反應低下、臨床試驗效果不佳，沒有得到廣泛的應用。
　　90年代核酸疫苗以其突出的優點，引起了研究人員的極大興趣，Sedegah等（1994）用約氏瘧原蟲環子孢子蛋白（CSP）基因真核表達質粒肌肉注射小鼠后，可產生抗環子孢子蛋白特異性抗體和CTL反應，兩種反應的水平均高于減毒子孢子免疫的小鼠。接種DNA疫苗的肝期原蟲用5×105子孢子攻擊，可使感染負荷下降86%；接種2～3次DNA疫苗的小鼠，再以102子孢子攻擊，結果顯示疫苗對68%的小鼠具有保護作用，說明接種核酸疫苗可用于抗瘧疾感染。
　　目前，用作瘧原蟲核酸疫苗研究的保護性抗原基因主要有：CSP、MSA1、MSA2、SSP2、HEP17、EXP1和RESA等。1997年Butler等在Nature上報道了一項臨床試驗，以一種編號QS21的試劑為佐劑，接種含環子孢子瘧原蟲蛋白基因的核酸疫苗，結果7個志愿者經感染有瘧原蟲的蚊子的反復叮咬后有6人獲得了保護。該項試驗為寄生蟲核酸疫苗應用于人體提供了寶貴的經驗。
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　　利什曼原蟲(Leishm aniaspp)不同種及亞種引起不同類型的利什曼病, 分別具有不同的流行病學特征。利什曼病疫苗可分為組分抗原、經遺傳手段轉化的無毒活蟲株、合成和重組抗原、表達利什曼抗原的重組菌/病毒和DNA 疫苗, 大多數均處于臨床前期。
　　在分子疫苗候選抗原研究方面也取得了重大進展，如表面糖蛋白GP63、Lack抗原和蟲體表面抗原2(PSA -2)。其中GP63已進行了廣泛而深入的研究, 該糖蛋白是迄今為止研究最深入的一種細胞外酶, 又稱“主要表面抗原”或“前鞭毛體表面蛋白酶(PSP)”,約占前鞭毛體總蛋白量的1%。
　　這些抗原加佐劑免疫可在試驗動物誘導明顯保護性，但這些佐劑可能不適合應用于人；已找到其他途徑用感染載體如BCG，沙門氏菌和豆苗病毒構建重組BCG表達的利氏曼表面抗原GP63，并證明可誘導小鼠對利氏曼原蟲的保護性免疫力。編碼GP63基因還在致弱鼠傷寒沙門氏桿菌表達，并用口服途徑免疫小鼠。Xu等用含編碼利什曼原蟲GP63基因核酸疫苗pcDNA1-GP63直接免疫BALB/c鼠，檢測到質粒在小鼠至少存在40天，抗體免疫組化染色顯示高水平表達的GP63。碩大利什曼原蟲攻擊感染，發現鼠已產生高度抵抗力。利什曼原蟲抗原能誘導免疫小鼠產生高水平細胞因子，通過Th1型細胞免疫抵抗攻擊。BALB/c小鼠一般對利什曼原蟲感染敏感，因為它不能激活Th1反應，除非加入外源性的IL-12。劉全等（2003）還證明Lack抗原基因也能誘導小鼠產生對利什曼原蟲產生保護性免疫。
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　　血矛線蟲、食道口線蟲及仰口線蟲是牛、羊分布最廣、危害最大的一類消化道線蟲病，目前主要采用芬苯噠唑和阿維菌素類藥物治療，疫苗研究也較多且有成功的報道。Munn等(1987)發現用存在于線蟲腸道微絨毛表面的contorton蛋白免疫羊后，可使捻轉血矛線蟲感染下降78%。從此，腸道相關抗原的研究就成了吸血線蟲及其他吸血寄生蟲的研究熱點。
　　H11是110kDa的膜內在蛋白，具有氨膚酶A及M 活性，與消化血液有關，與抗體結合后，可破壞III期以上蟲體的消化功能，保護率與抗體滴度呈正相關，但在自然感染情況下無免疫原性，有可能屬于“隱蔽抗原”。H11疫苗的免疫效果相當令人滿意，免疫羊保護率可達90%以上，保護期達23周以上，且不影響自然免疫，母體還可通過胎盤將抗體傳給胎兒。捻轉血矛線蟲的其他腸道相關抗原也可誘導羊產生高水平的免疫保護，如H-gal-GP和TBSP，目前，國外在重組H l l 、H-gal-GP及TBSP疫苗方面的進展很快。
　　但上述所有分子的抗原表位都含有復合糖的組分，很難在常規表達載體(E. Cole ,酵母及病毒)中正確表達，故Redmond等(2001)開始用于體外繁殖且能自由生活的線蟲，如Caenorhabditisele,gans，進行這些抗原的體外表達，已獲得可喜進展。
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　　在血吸蟲方面，已發現多個有一定免疫保護作用的抗原，如副肌球蛋白(rSj 97) , GST, FABP、膜蛋白(Sj23),卵黃鐵蛋白(Ferl )、抗凋亡因子(Dadl)等。
　　Yang和Waine等分別通過對小鼠肌肉注射攜帶編碼日本血吸蟲副肌球蛋白、26和28 KDa谷胱甘肽-S-轉移酶、鈣網硬蛋白、磷酸丙糖脫氫酶、22.6 KDa膜蛋白、14 KDa脂肪酸結合蛋白基因質粒DNA（該6種蛋白分子為目前公認有希望的血吸蟲疫苗候選分子），但僅僅副肌球蛋白核酸疫苗誘導了鼠特異性抗體的產生。而Kayes等用曼氏血吸蟲28 KDaGST核酸疫苗免疫小鼠，在血清中測有特異性抗GST IgG抗體。國內李傳明等的實驗結果也表明，日本血吸蟲26 KDa GST-DNA疫苗免疫小鼠后能誘生一定水平的抗血吸蟲抗體，免疫鼠可形成一定的預防血吸蟲尾蚴感染的保護性免疫力；同時可減輕宿主肝組織血吸蟲卵所致的病理損害作用。
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　　囊尾蚴病和棘球蚴病是發展中國家主要的人畜共患病，危害非常嚴重，可喜的是囊尾蚴及棘球蚴重組疫苗的研究均相當成功。棘球蚴苗EG95可誘導牛產生96%~100%的保護率，這已在澳大利亞、新西蘭、阿根廷及中國等地的試驗中獲得證實。羊帶絳蟲苗45w可誘導羊產生92%以上的保護率，對牛的無鉤絳蟲也有較高的保護率。
EG95,45w及羊帶絳蟲中含類似結構的其他抗原(To18/To16)To18及To16均是在大腸桿菌中誘導表達的，具有種間交叉保護作用。如羊帶絳蟲的45w , To 18及To16抗原混合后可誘導豬對有鉤絳蟲的攻擊感染產生保護(保護率達93%)。另一些抗原，如六鉤坳的FABP，亦可作為疫苗后選抗原。Chabalgoity等(2001)以減毒沙門氏菌為受體菌，表達了該抗原，經口免疫犬后，發現可誘導相應的體液及細胞免疫反應。
　　李文桂等（2008）用多房棘球絳蟲重組BCG-Em14-3-3疫苗用皮下注射和鼻腔內接種分別免疫BALB/c鼠，免疫8周后用多房棘球絳蟲原頭節進行攻擊感染，觀察小鼠脾細胞因子的變化，結果顯示多房棘球絳蟲重組BCG-Em14-3-3疫苗誘導小鼠產生一個Th1型反應，從而對抗Em原頭節攻擊感染。
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　　何宏軒等將編碼C.parvum子孢子15KD CP15表面蛋白基因插入真核表達載體pCR3.1（+）中構建重組質粒pCR3.1-15，然后經鼻黏膜免疫懷孕成年山羊，發現抗CP15抗體存在于免疫山羊的血漿和初乳中。pCR3.1-15經鼻腔免疫的懷孕山羊產生的免疫力能傳給子代，使子代對C.parvum感染產生保護。他們進一步用含有C.parvum表面蛋白CP15/60基因的重組質粒pcDNA3-15/60經鼻黏膜免疫接種BALB/c小鼠，再使其經口接種微小隱孢子蟲卵囊。發現該質粒能誘導機體產生系統和粘膜免疫應答。
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　　M ev elec 等研究發現用分別表達弓形蟲兩種抗原SAG1 和GRA4 的質粒免疫C57BL/6 小鼠。經攻毒保護試驗發現，小鼠可獲得62％的存活率。而用聯合表達的質粒免疫后則獲得75％的存活率。若在聯合免疫的同時再注入表達粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子，則可獲得87％的存活率。韓廣東等用攜帶了弓形蟲POP2 基因的質粒DNA 免疫小鼠，發現該疫苗能使小鼠產生強烈的細胞、體液反應，并延長小鼠的存活時間，推遲了開始死亡的時間。弓形蟲病核酸疫苗的候選基因有：表面膜蛋白P30基因、P22 基因；棒狀體蛋白基因ROP1 基因、R0P2 基因；致密顆?？乖?GRA）基因等。
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　　蠅、虱、螨、蜱等體外寄生蟲嚴重危害著牛、羊的健康，在預防這些寄生蟲的疫苗中，用于預防牛的微小牛蜱的疫苗（willadsen，1995），即澳大利亞Biotech及CSIRO(聯邦科學及工業研究組織)研制的大腸桿菌表達的微小牛蜱基因工程苗(Bm86疫苗-TickGardTM)，商品名為TickGard，現Biotec公司生產了第二代微小牛蜱苗--Tick-Gard Plus，免疫效果更強，目前已在加拿大獲準生產。與此類似的是用古巴酵母Pichia pastorale，表達的Gavac苗，并由HeberBiotec公司生產，一種針對牛紋皮蠅的蛋白酶（hypodermin A）的重組疫苗在實驗中也獲得成功，已被批準由加拿大的Alberta作為商品疫苗銷售。除以上三種疫苗外，其他體外寄生蟲，如旋皮蠅、蛙虱、東方血蠅等疫苗也正處于研制之中。

　　三、展望
　　隨著各學科的迅速發展和相互之間的滲透，尤其是現代生物技術發展的日新月異，為寄生蟲病免疫學研究提供了強有力的工具。怎樣快速高效地發現保護性抗原或表位,一直是抗寄生蟲分子疫苗研究的熱點課題,基于寄生蟲本身及其與宿主相互作用的生物學和免疫學特征，通過實驗技術鑒定疫苗候選分子始終是最根本的方法。
　　但隨著寄生蟲功能基因組學的發展,積累了大量的可進一步挖掘利用的分子序列資料。因此,近年發展的反向疫苗學方法,即先對這些序列進行免疫信息學理論預測分析,然后結合實驗鑒定獲得疫苗候選分子或表位,可望加快寄生蟲分子疫苗的研發進程。
　　目前,已有一些理論預測結合實驗鑒定寄生蟲Th細胞表位的工作,除個別研究小組對惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)保護性表位篩選整體策略上采用的反向疫苗學方案外,基本上是對已知的候選疫苗分子進行Th細胞表位的繪制,都為理論預測結合實驗鑒定技術發現保護性抗原表位積累了基礎資料。如果能合理地利用它們，使之更好的為寄生蟲疫苗研發服務，將成為今后廣大科研工作者的研究熱點和重點。
　　參考文獻略
　　作者：王軍（1982- ），男，助理獸醫師，大學本科，主要從事動物疫病的診斷與防治工作。E-mail：wjrz520@sina.com TEL：13909987069 0998-6186379

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