H9N2亞型禽流感病毒疫苗研究進展

來源：  發布日期：2011-02-22  發布者：曉天  共閱1319次

　摘　要：H9N2亞型禽流感病毒在世界范圍內廣泛存在，給養禽業造成巨大的經濟損失，并危害人類健康。流感病毒抗原易發生漂移和轉換，使流感病毒的防控變得困難。疫苗接種是防控禽流感最有效的手段之一，全病毒滅活疫苗保護效果好，制備簡單，是流感病毒常用的疫苗，但該疫苗局部副反應大，并伴隨生物安全問題。隨著分子生物學技術的發展，活載體疫苗、核酸疫苗、亞單位疫苗等新型疫苗的開發，給H9N2亞型禽流感病毒的防控提供了新的手段。新型疫苗除具有傳統疫苗的保護效果外，在生物安全和普遍防控方面具有廣泛的優勢，是流感病毒疫苗發展的新方向。

關鍵詞：禽流感病毒；H9N2亞型；疫苗

　　禽流感(Avian influenza，AI)是由A型流感病毒(Avian infnenza virus，AIV)引起的一種禽類的高度接觸性傳染病，雞、火雞、鴨、鵝和鵪鶉等家禽及野鳥、水禽、海鳥等均可感染。A型流感病毒屬于正黏病毒科，基因組是負義單股RNA，分為8個片段。根據表面抗原血凝素(hemagglutinin ，HA)和神經氨酸酶(neuraminidase ，NA)的抗原性不同，可將A型流感病毒分成若干亞型，目前，已發現了16種HA和9種NA亞型。A型流感病毒具有宿主特異性，感染禽類并致病的通常是H5、H7和H9亞型。H9N2亞型禽流感病毒最早于1966年從北美的火雞體內分離得到，1994年開始在中國大陸的家禽中出現，最近幾年在經濟性家禽中普遍暴發[1]。H9N2亞型雖然為低致病性禽流感病毒(Lowly pathogenic avian influenza virus， LPAIV)，但可造成蛋雞的產蛋量嚴重下降，肉雞和青年雞的復合型呼吸道疾病和死淘率升高，往往造成嚴重的經濟損失。1999年出現的H9亞型AIV感染人的事件，更是給人類的健康帶來了巨大威脅。H9亞型禽流感病毒在經濟上和公共衛生上的重要地位，越來越引起人們的廣泛關注。與其他病毒性疾病一樣，禽流感的防治尚無特別有效的方法，接種疫苗是預防禽流感發生與傳播的最有效手段。近年來，隨著分子生物學技術的不斷發展，為禽流感新型疫苗的開發提供了理論依據和技術手段，除傳統的滅活疫苗外，還進行了活載體疫苗、亞單位疫苗和核酸疫苗等方面的探索，本文就近年來H9N2亞型禽流感疫苗的研究現狀做一綜述。

　　1　滅活疫苗

　　滅活全病毒疫苗一般是用甲醛滅活禽流感病毒雞胚尿囊增殖液，并輔以佐劑制成，有良好的免疫作用。根據需要可制備針對幾種不同亞型病毒的多價疫苗。李明義等[2]用A型禽流感病毒A/Ostrich/Denmark/77420/96(LPAI­H5N2 )株及A/Chicken/ Shanghai/1/98(H9N2)株分別接種易感雞胚，收獲感染胚液超濾濃縮后經甲醛滅活，加油佐劑混合乳化制成油乳劑滅活疫苗。疫苗接種4周齡SPF雞，試驗表明疫苗安全。取疫苗1羽份接種4周齡SPF雞進行效力試驗，免疫雞群全部獲得保護，對照雞群全部感染或死亡。經不同免疫劑量測定，證明1羽份疫苗至少含有8個免疫劑量。免疫干擾試驗證明兩種抗原具有免疫協同作用。

　　禽流感、新城疫、傳染性支氣管炎對雞群危害巨大，且免疫程序相近，為減少接種次數，達到更好的保護效果，多制成聯苗進行免疫防控。劉佃章等[3]用本地分離的禽流感病毒H9毒株和新城疫病毒La Sota株經雞胚增殖，滅活后制成禽流感H9、新城疫二聯滅活油佐(乳)劑疫苗，經效力檢驗和攻毒試驗，5日齡白羽肉雞免疫后15 d，抗體效價可達1∶32以上，并能夠保護免疫雞免受禽流感病毒的自然感染，新城疫病毒的抗體效價也達到較高的水平。2007年1月，洛陽普萊柯生物工程有限公司宣布禽流感(H9N2)、新城疫、傳染性支氣管炎三聯滅活疫苗研制成功，對3萬多只雞的臨床試驗證實疫苗安全有效。禽流感三聯苗不但有效解決了新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感等3種病毒病免疫程序接近，免疫間相互干擾，重復免疫應激等生產應用中的重大問題，而且使用成本僅為單苗相加的50%。滅活疫苗制備工藝簡單，免疫保護效果較好，能有效避免禽流感的大規模暴發和流行。

　　2　基因重組活載體疫苗

　　重組雞痘病毒疫苗是一類研究較為深入、具有廣闊應用前景的禽用基因工程疫苗，用于構建重組雞痘病毒的載體一般為雞痘病毒疫苗株，它們的毒副作用小，安全性高。擴增禽流感病毒HA基因，插入雞痘病毒載體使其表達HA蛋白，制成基因重組活載體疫苗，抵御禽流感病毒的攻擊。陳平等[4]將禽流感病毒H9亞型HA基因克隆插入載體pFG11S中，與禽痘病毒疫苗株(wFPV)共轉染雞成纖維細胞(CEF)得到重組病毒rFPV­Ps­HA，以間接免疫熒光法證實HA基因得到了表達。將該病毒經頸部皮下接種1日齡SPF雞， 接種后15 d以H9亞型禽流感病毒F株翅靜脈攻毒，攻毒后第5天采集泄殖腔棉拭子樣品進行病毒分離，發現疫苗組均能很好地抑制排毒，攻毒對照組泄殖腔的排毒率明顯高于氣管排毒率。陳素娟等[5]應用相同的技術構建了同時表達H5和H9亞型禽流感病毒分離株的血凝素(HA)基因的重組雞痘病毒，初步動物試驗表明， 用該重組雞痘病毒免疫SPF雞，免疫后血凝抑制(HI) 抗體監測陽性率均為100%(8/8)；該重組病毒能顯著抑制H9亞型AIV滴鼻、點眼后7日齡SPF雞從氣管和泄殖腔排毒，同時也能抵抗H5亞型AIV肌肉注射后對7日齡SPF雞致死性攻擊，保護率均為100 % ，具有一定的應用前景。程堅等[6]構建了共表達H9亞型HA基因和IFN­Ⅱ的重組雞痘病毒，不僅能顯著抑制靜脈攻毒后1日齡SPF雞及含抗FPV母源抗體的商品雞從泄殖腔排毒，且能減輕單表達HA的重組雞痘病毒抑制1日齡SPF雛雞增重的副作用。

　　3　亞單位疫苗

　　亞單位疫苗是利用病原微生物表面結構成分制成的不含核酸，能誘導機體產生保護性免疫應答的疫苗。禽流感亞單位疫苗是提取禽流感具有免疫原性的蛋白，加以佐劑制成的。隨著重組DNA及分子克隆技術的發展，可以將表面基因連接到載體質粒，然后導入表達系統中，經誘導可獲得大量表達的免疫原性蛋白，加入佐劑制成基因工程亞單位疫苗。

　　Pushko P等[7]擴增H9N2亞型流感病毒A/Hongkong/1073/99 (H9N2)株的HA、NA和M1基因，克隆至pFastBac1桿狀病毒轉移載體上，轉染昆蟲細胞系sf9，獲得大量表達的HA﹑NA和M1蛋白，并自動組裝成直徑為80 nm～120 nm的病毒樣顆粒，該病毒樣顆粒具有流感病毒血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)活性，肌肉注射免疫Balb/c小鼠，抗體效價在104～105之間，能有效阻止流感病毒在上呼吸道和肺部的復制。Pushko P等[8]在重組的HA蛋白中加入Novasome佐劑，增強了重組蛋白的免疫原性，使用更少的重組蛋白即能產生良好的免疫效果。桿狀病毒表達系統由于具有蛋白翻譯后加工過程，與原核表達的蛋白相比更接近病毒蛋白的原始構象，在亞單位疫苗的開發中具有良好的運用前景。

　　4　核酸疫苗

　　核酸疫苗又稱DNA 疫苗，是利用重組DNA技術將編碼保護性抗原蛋白的基因克隆到真核表達載體上，在被直接導入到動物體內后，保護性抗原蛋白基因表達的抗原蛋白經內源性途徑呈給免疫系統，誘導機體產生特異性的體液免疫和細胞免疫反應。Qiu M Z等[9]用H9N2亞型禽流感病毒A/Chicken/Jiangsu/7/2002株感染Balb/c小鼠，傳至5代后，A/Chicken/Jiangsu/7/2002株能在小鼠肺內穩定增殖，并能致死小鼠。用表達同源H9N2亞型的HA和NA基因的核酸疫苗免疫小鼠，一免或二免后用致死量的A/Chicken/Jiangsu/7/2002株攻毒，觀察小鼠存活時間，測定小鼠血清抗體效價和肺組織內病毒殘留滴度對免疫保護效果進行評價。結果顯示，用10 μg表達HA和NA基因的核酸疫苗免疫一次能有效保護同源H9N2亞型禽流感病毒的攻擊。

　　核酸疫苗能長時間表達抗原，避免母源抗體的干擾，并且沒有散毒及毒力回升的危險，但現今開發的核酸疫苗存在在體內表達效率不高，免疫保護效果不好等缺點，需要進行進一步的研究才能用于實際生產。

　　5　通用疫苗

　　禽流感病毒亞型眾多，各亞型表面抗原基因易發生漂移和轉換，是流感病毒防控的難點，如何能尋找一種“通用疫苗”，對各亞型具有交叉保護，是流感病毒防控策略之一。研究表明，A型流感病毒M2蛋白在各亞型之間相對保守，是有效的疫苗靶點，為通用疫苗的開發奠定了理論基礎[10]。Ernst W A等[11]擴增H1、H5和H9亞型流感病毒M2蛋白外功能區M2eA表位片段，將其融合構建于帶有疏水蛋白的表達載體(如pET28a)上進行融合表達，以脂質體為佐劑免疫小鼠。結果表明，M2eA表位疫苗能刺激機體產生針對M2eA表位的IgG亞型抗體，顯著減少流感病毒在呼吸道的復制和增殖，用致死量的同源性H1N1和H9N2亞型病毒攻擊免疫小鼠，保護率分別為100%和80%，用致死量的H6N2亞型流感病毒進行攻擊，保護率為100%。表明M2eA表位疫苗對各亞型流感病毒均有一定保護效果，為流感病毒通用疫苗的研究奠定了基礎。

　　6　反向遺傳技術在禽流感疫苗開發中的運用

　　反向遺傳技術(reverse genetics)又叫“病毒拯救(rescue of virus)”，是近幾年研究的一項新方法，應用于病毒研究。病毒拯救技術是在了解病毒復制的特點等的基礎上，利用分子生物學技術建立和完善起來的，是通過人工操作基因，用病毒核酸的適當形式在一定條件下轉染細胞，產生有感染性的病毒粒子。經過多年的發展，現在病毒拯救指的就是完全以質粒為基礎的系統，即從克隆的cDNA產生病毒的過程[12]。病毒拯救在對病毒的生活周期、基因結構與功能、致病基礎、新型疫苗構建、表達外源蛋白等方面的研究中顯示了良好的應用前景[13]。Neumann G等[14­15]分別報道了完全以質粒為基礎的流感病毒拯救，允許人工對流感病毒基因進行操作，引入預期突變位點，使重組病毒具有預期(冷適應、減毒等)表型，為流感病毒新型疫苗的開發提供了有力工具。反向遺傳技術已成功用于人用流感病毒減毒活疫苗的開發，2003年在美國，應用反向遺傳技術開發的流感病毒減毒三價活疫苗FluMist™被批準和投入使用，該流感減毒活疫苗在成年人和兒童中都有良好的安全性，可以有效預防流感[16]。該技術也已用于禽流感病毒的研究，石火英等[17]應用反向遺傳技術將含有1998 年中國大陸分離株H9N2 亞型禽流感病毒的8個基因片段的質粒共轉染COS­1 細胞，產生了與野生病毒生物學特性相同的H9N2亞型AIV。應用反向遺傳技術，可將具有低致病性的H9N2亞型禽流感病毒作為骨架病毒，與不同毒株的表面HA、NA基因進行重組，產生重配病毒，作為候選疫苗?？梢灶A見，反向遺傳技術將是以后開發有效禽流感病毒疫苗候選株的有力手段。

　　7　結語

　　禽流感病毒的亞型眾多、分布廣泛、傳播渠道復雜，病毒自身的特點和疫苗選擇壓力使病毒容易發生重組、重排而使其抗原性和致病性發生變化，造成免疫失敗，這些特點給禽流感的防治工作帶來了很大的困難。H9亞型禽流感病毒對雞群的低致病性更使人容易忽略，因此，對禽流感病毒進行連續的分子病毒學監測，分析禽流感病毒變異規律，篩選出合適的疫苗株，應用先進的分子生物學技術研制出高效、安全、工藝簡單、價格低廉的禽流感疫苗是禽流感病毒研究者努力的方向。

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